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百趣代谢组学资讯: 哮*真的和痰液有关系？来问问科研大佬们怎么看。下面跟着小趣一起，透过「痰液代谢组学」认识不同炎症亚型哮*吧。近日，四川大学华西医院王刚教授团队在AllergyAsthma & Immunology Research（IF=5.096）上发表了题为"Sputum Metabolomic Profiling RevealsMetabolic Pathways and Signatures Associated With Inflammatory Phenotypes inPatients With Asthma"的论文。四川大学华西医院王刚教授是论文第一通讯作者，刘影博士是论文第一作者；上海百趣代谢组学技术研究中心创始团队刘志鹏研究员和研究人员王洪光为论文共同作者。百趣乐鱼电竞为本次研究提供了非靶向代谢组学+靶向代谢组学服务。哮*是一种严重的全球性慢性炎症性气道疾病，其特点是气道高反应性和可逆性气道阻塞导致的反复发作的*息、气短、胸闷和**。同时，哮*也是一种具有不同表型和内型的异质性疾病，其中哮*的炎症表型（嗜酸性粒细胞性哮*[EA]、中性粒细胞性哮*[NA]和少粒细胞性哮*[PGA]）根据诱导的痰粒细胞不同比例而被广泛认知。尽管可以为不同炎症表型的患者量身定制管理方法，但针对特定炎症表型，尤其是NA的治疗策略尚且缺乏，这代表了哮*的医疗需求有待被满足。同时，驱动哮*不同炎症表型的分子机制知之甚少，并且可能是异质的。因此，识别特定的乐鱼电竞标志物并了解哮*不同炎症表型的分子机制非常重要，这可能会导致更加个性化的医疗。本研究通过非靶向与靶向代谢组学方法，以识别不同炎症性哮*表型患者的痰液代谢组学特征和潜在的分子途径，以期探索这些特征是否与控制哮*和加重哮*风险相关。一、样本设置发现集（discovery set）119个痰液样本：验证集（validation set）114个痰液样本：二、临床特征验证集中，炎症细胞因子结果显示在哮*表型中，EA患者的IL-5水平最高，而TNF-α、IL-1β、IL-8水平最低（p）。与之相反，NA组IL-1β水平最高，IL-5水平最低（均P）（表1）。在12个月的随访中，有3例（10%）NA患者和3例（6.1%）PGA患者失访。最后，108例哮*患者（EA,n=35；NA,n=27；PGA,n=46）纳入哮*加重分析。结果显示，不同表型组中，严重哮*发作的患者比例（EAvs NA vs PGA:17.1% vs 37% vs 6.5%,P=0.004）和严重哮*发作次数的频率（EAvsNAvs PGA: 0.29±0.75 vs 0.70±1.33 vs 0.09±0.35,P=0.004）存在显著差异（表1）。表1. 数值表示为平均值±标准差、数字(%)或中位数（下四分位数、上四分位数）。EA，嗜酸性粒细胞性哮*；NA，中性粒细胞性哮*；PGA，少粒细胞哮*；BMI，体重指数；BDP，二丙酸倍氯米松；LTRA，白三烯受体拮抗剂；SPT，皮肤点刺试验；ACQ，哮*控制问卷；AQLQ，哮*生活质量问卷；FEV1，一秒用力呼气量；FVC，用力肺活量；BDR，支气管扩张剂反应；FeNO，呼出的一氧化氮分数；IgE，免疫球蛋白E；TNF，肿瘤坏死因子；干扰素，干扰素；IL，白细胞介素；MDC，巨噬细胞衍生的趋化因子。与EA组比, aP与NA组相比, cP。三、非靶向代谢谱可区分发现集中不同炎症性哮*表型和健康受试者OPLS-DA分析表明不同哮*炎症表型之间明显分离。此外，哮*组也与健康对照组明显分开（图1）。每个模型中Q2截距的低值表明这些模型的稳健性，因此在所有比较中显示过拟合的风险较低，组间差异显著。图1. 发现集中，非靶向代谢谱在不同炎症表型哮*和健康受试者中有所区别。(A-D) 不同炎症性哮*表型和健康受试者的PCA模型评分图；(E-H) 不同炎症性哮*表型与健康受试者OPLS-DA模型的评分图；(I-L) 不同炎症性哮*表型与健康受试者OPLS-DA模型的置换检验结合单变量和多变量统计分析，基于OPLS-DA模型的VIP>1、倍数变化或>1.2和FDR，在不同的哮*表型和健康受试者之间共发现77种差异代谢物（图2）。图2. 发现组中不同炎症表型哮*和健康受试者痰样本中差异代谢物热图四、发现集中的代谢组学通路分析应用MetPA代谢组学通路拓扑结构富集分析方法来评估不同哮*表型和健康受试者中病理生理机制潜在途径的重要性（图3）。结果显示，组氨酸代谢途径在哮*组和健康对照组之间存在差异（P=0.019；影响值=0.189）。EA和NA之间的差异代谢物富集在甘油磷脂代谢（P=0.015；影响值=0.121）、烟酸和烟酰胺代谢（P=0.020；影响值=0.332）和组氨酸代谢（P=0.022；影响值=0.189）。EA和PGA之间的差异代谢物富集在甘油磷脂代谢（P=0.001；冲击值=0.186）、亚油酸代谢（P=0.001；影响值=1.000）、组氨酸代谢（P=0.014；影响值=0.189）和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的乐鱼电竞合成（P=0.046；影响值=0.500）。NA和PGA之间的差异代谢物富集在亚油酸代谢（P=0.002；影响值=1.000）、甘油磷脂代谢（P=0.010；影响值=0.160）和烟酸、烟酰胺代谢（P=0.015；影响值=0.332）。图3. 基于能区分不同炎症表型哮*和健康受试者痰样本的代谢物的代谢通路分析。(A) 哮*与健康；(B) EA和NA；(C) EA和PGA；(D) NA和PGA。圆圈表示可能涉及类分离的代谢途径。EA，嗜酸性哮*；NA，中性粒细胞哮*；PGA,少粒细胞性哮*。五、靶向定量验证集中不同炎症性哮*表型与健康受试者之间的差异代谢物经过文献调研和靶标定量方法检测分析评估，选择了39个差异表达代谢物，在验证集患者中进行靶向定量，其中24种代谢物在哮*炎症表型之间显著差异表达（表2），其中9种代谢物的显著P值为0.001或更低。组胺以及组氨酸代谢相关代谢物的表达量最高，而5-L-谷氨酰基-L-丙氨酸、烟酰胺、二氢胸腺嘧啶、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、丙氨酰亮氨酸、苯丙氨酰丝氨酸、苯丙氨酰苯丙氨酸在EA患者中表达量最低。这些数据与代谢通路拓扑结构富集分析结果一致，表明组氨酸代谢可能在EA中起重要作用。在NA患者中，涉及嘌呤代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢以及氨酰tRNA乐鱼电竞合成的腺苷5'-单磷酸、甘油酸、牛磺酸、二氢胸腺嘧啶、L-亮氨酸、酪胺、L-谷氨酸、丙氨酰亮氨酸、苯丙氨酰丝氨酸和苏氨酰苯丙氨酸的浓度最高，而甘油磷脂代谢相关代谢物甘油磷酸胆碱的浓度最低，与之相反，PGA中甘油磷胆碱的浓度最高。而且，PGA患者的不饱和脂肪酸相关代谢产物，十七烷酸和油酸的乐鱼电竞合成也最高，但十二烷酸的浓度最低（表2）。表2. 数值表示为中位数（下四分位数、上四分位数）。EA，嗜酸性粒细胞性哮*；NA，中性粒细胞性哮*；PGA，少粒细胞哮*。与EA组比,aP与NA组相比,cP。此外，通过受试者工作特征（ROC）曲线检测这些差异表达的代谢物，以区分不同的炎症哮*表型。牛磺酸、丙氨酰亮氨酸、苯丙氨酰丝氨酸和苏氨酰苯丙氨酸可作为鉴别NA与EA或PGA的候选代谢标记物，其AUC范围为0.816~0.975（P）（图4）。然而，由于单一代谢物的AUC均小于0.7，故不能有效区分EA和PGA。图4. 区分NA和EA (A) 或NA和PGA(B) 的代谢物受试者工作特征（ROC）曲线。EA，嗜酸性哮*；NA，中性粒细胞哮*；PGA, 少粒细胞性哮*。六、验证集中差异代谢物与临床指标和炎症特征的相关性相关性分析显示，差异表达的代谢物与所有哮*受试者的肺功能、哮*控制和炎症特征相关（图5）。在12个月的随访中，使用logistic回归和负二项回归模型探讨所有哮*患者痰液代谢物与严重哮*发作之间的关系。结果显示，腺苷5'-单磷酸与严重哮*加重显著相关（表3）。校正年龄、性别、BMI和FEV1%之后，腺苷5'-单磷酸与经历严重哮*发作的患者比例以及严重哮*发作频率呈正相关(RRadj=1.000,95%CI=[1.000,1.000],P=0.050；RRadj=1.000,95%CI=[1.000,1.000],P=0.008)。同时，尿囊素和烟酰胺与严重哮*发作频率均呈正相关(RRadj=1.000,95%CI=[1.000,1.000],P=0.043；RRadj=1.001,95%CI=[1.000,1.002],P=0.021)。此外，对嗜酸性哮*(EA)或非嗜酸性哮*(NEA)进行了亚组分析。结果显示，腺苷5'-单磷酸仍与NEA组的严重哮*恶化显著相关，但与EA组无关。而且，我们还发现腺嘌呤、别胱硫醚和烟酰胺也与NEA组严重哮*发作显著相关。然而，由于EA组的样本量有限，只发现酪胺与严重哮*发作的频率相关。 图5. 验证集中所有哮*受试者差异代谢物与临床和炎症特征相关性热图。FEV1，一秒用力呼气量；FVC，用力肺活量；ACQ，哮*控制问卷；AQLQ，哮*生活质量问卷；FeNO，呼出的一氧化氮分数；IgE，免疫球蛋白 E；TNF，肿瘤坏死因子；干扰素，干扰素；IL，白细胞介素；MDC，巨噬细胞衍生的趋化因子。表3. 根据年龄、性别、BMI和FEV1进行了校正。OR，优势比；CI，置信区间；BMI，体重指数；FEV1，一秒用力呼气量。七、结论不同炎症性哮*表型的代谢组学研究分析可以发现，不同亚型间累计有77个差异显著代谢物变化和5条差异显著代谢通路变化。这些代谢组学通路主要是组氨酸代谢、甘油磷脂代谢、烟酸和烟酰胺代谢、亚油酸代谢、以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的乐鱼电竞合成。此外，还发现差异代谢物与哮*的临床和炎症特征相关，这些代谢物可能能够作为不同炎症性哮*表型的潜在治疗靶点。文/阿趣代谢组学...
2022年4月19日，中山大学附属第一医院陈旻湖教授、冯瑞博士及其研究团队在《Clinical Nutrition》（IF=7.643）杂志上在线发表题为“Dietary inflammatory potential mediated gut microbiota and metabolite alterations in Crohn’s disease: A fire-new perspective”的研究论文。本研究中通过分析285名健康受试者（HCs）和150名新诊断的克罗恩病（Crohn’s disease, CD）患者，利用饮食炎症指数（Diet inflammatory index, DII）来评估HCs与CD患者饮食中的炎症风险，分析发现CD患者在确诊前一年的饮食具有潜在的促炎作用，即促炎饮食与CD风险和疾病活动度密切相关。随后进行了粪便宏基因、粪便、血清代谢组学的测定和分析。通过研究发现的促炎饮食相关菌群-代谢改变可能参与了CD的发病。8月12日 19:00，麦特绘谱特邀冯瑞博士担任绘谱学堂主讲嘉宾，分享《促炎饮食通过介导肠道菌群及代谢物改变促进克罗恩病发病的作用及潜在机制》的主题报告。课后特设答疑环节，邀您与嘉宾线上交流探讨学术话题。诚挚欢迎您报名参与！报名方式识别下方二维码填写报名申请即可参与！请添加工作人员微信（微信号：jclin1605），我们会邀请您加入学术交流群，直播链接会提前在群里公布。期待您的加入！ 嘉宾介绍 — 冯瑞 博士 — ● 2014年美国辛辛那提大学获得Ph.D学位● 中山大学附属第一医院消化内科 现任副主任医师、助理研究员主要的研究方向是炎症性肠病（IBD），研究重点为肠道微生态在IBD发病及诊治中的作用及机制，发表SCI论文40余篇，主持国自然基金项目、省自然基金、中山大学人才项目。 往期推荐1. 喜报 | 麦特绘谱获上海市“专精特新”企业殊荣2. Gastroenterology | 饮食干预下的儿童克罗恩病的粪便代谢组改变3. 客户案例 | Nature Aging：多组学研究揭示我国长寿老人肠道菌群与代谢组特征4. 成果速递 | 麦特绘谱2022年度上半年高分项目文章集锦5. 科研与转化 | 减脂界的黄金CP：揭示茶褐素+茯苓多糖降脂功效及机制6. 研究了百余年的胆汁酸，新的突破点在哪里？...
近日，中国科学院微乐鱼电竞研究所研究员王军团队在NatureCommunications（IF=14.919）上发表了题为"Short- and long-readmetagenomics expand individualized structural variations in gut microbiomes"的论文。 中国科学院微乐鱼电竞研究所王军研究员和动物所宋默识研究员为共同通讯作者；中国科学院微乐鱼电竞研究所助理研究员陈亮和赵娜，博士研究生曹家宝，硕士研究生刘小林等为第一作者；上海百趣代谢组学技术研究中心创始团队刘志鹏研究员和研究人员范艳群为论文共同作者。该研究建立了ONT三代测序和Illumina二代测序数据混合组装的新方法（图1a），检测出了更多包括插入突变、缺失突变和基因倒位在内的结构变异（structural variations, SVs）。同时，通过对100个人组成的健康人群横断面队列和由10个人组成的纵向跟踪队列的宏基因组学和代谢组学的联合分析，发现了SVs在不同个体间存在明显不同，但在同一个体内有相对稳定，同时也发现SVs不仅影响菌群与代谢物的功能，对人体表型也有一定影响。研究团队首先用已知数据集（ZymoBIOMICS™ Microbial Community）对ONT和Illumina的混合组装方法与其他几种组装方式进行比较，发现混合组装方式从完整度、污染率、细菌基因组平均遗传相似度（average nucleotide identity, ANI）和编码密度方面都有更好的效果。同时通过对两个人群的肠道数据分析发现，混合组装方式能提高数据质量。与二代宏基因组组装结果比较发现，混合组装方式虽然少了17.3%的contigs，但组装序列数量多了5.1%，N50值提高了3倍多。对contigs进行分箱后得到能代表单个菌种的重建宏基因组装基因组(metagenome-assembled genomes，MAGs)，通过混合组装方式得到平均N50为117kb的9,612个MAGs（每个样本20~83个），去重后得到692个MAGs（图1b，1c），其中有623在UHGG数据库中，且有208个MAGs的质量更高，同时也发现了67个新的genomic bins，用新版本dRep去重后减少了2个MAGs。从全面性考虑，159个非冗余的MAGs均包含了23S、16S和5S rRNA序列，448个MAGs至少含有其中一种类型的rRNA。基于Illumina的组装方式得到616个MAGs，N50约为混合组装的一半，且只有9个MAGs含有三种类型的rRNA序列，258个MAGs含有至少一种rRNA序列。所有样本中，Fusicatenibacter saccharivorans出现的频率最高，其次是Anaerostipes hadrus和gathobacterrectalis，有189个菌以MAGs的形式出现在至少10个样本中。鉴于ONT测序能发现更多SVs的特点，通过MAGs的比对，发现多种类型的SVs。189个菌通过dRep比对，鉴定出了317558个插入突变，34129个缺失突变和1373个基因倒位（图1d）；接下来又随机选取插入突变和缺失突变两个峰中（140~160bp和1050~1150bp，图1e）SVs片段进行分析，发现移动元件和染色体外移动基因元件(extrachromosomal mobile genetic elements，eMGEs)在两种突变的短SVs片段中更多，从而推断短序列的SVs可能与噬菌体整合和其他移动元件相关；但并不是所有SVs都有可检测的移动元件，其他的SVs可能是复制和重组引起，具体机制有待进一步验证。图1. 三代和二代混合组装方式验证结果接下来，通过重新匹配参考MAG或者MAG中含有SV的序列，以进一步验证检测出的SVs。人工匹配后发现97%以上随机挑选SVs集与ONT多处位置的Reads数目一致，从而验证了单分子测序得到特异SVs的可靠性（图2a），同时也发现同一个体相同细菌基因SVs的低异质性。对种水平（MAGs）的SVs分析发现，SVs总数与所有样本中的MAGs数和基因大小正相关。但由于细菌基因组中SVs在人群中分布的不均匀性，所以进一步校正平均SV数和基因组大小，发现1M基因组中门水平多样性最高的Firmicutes有20.4的SVs,Akkermensia所属的Verrucomicrobia有19.5的SVs,而Desulfobacteroita和Proteobacteria的SVs最少（图2b,2c）。对两个人群的189个MAGs分析发现，不同个体间每Mb基因组中有16.7的SVs，而同一个体不同时间点每Mb基因组种SVs的中位值为0。因此，SVs可用于区分个体间的细菌种类和肠道菌群，同时对于特定菌10天内在个体内的稳定性（图2d）结果间接表明LifeLines cohort队列发现的3年内菌株分化或置换可能是由于SV的逐步累积引起。、图2. 人体肠道微乐鱼电竞结构变异结果接下来，对人群中检测出来的SVs相关的基因进行功能富集分析，发现267个通路与插入突变和缺失突变（图3a）相关，但未发现与基因倒位相关的通路，前30个通路中有19个通路是与多糖降解、鞘脂代谢组学等与代谢组学相关的通路；同时也发现一些与环境信息处理相关的通路（如磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS)和ABC转运蛋白等）。为进一步研究SVs对机体功能（尤其是微乐鱼电竞代谢组学）的影响，对横断面队列的粪便、血清和尿液样本进行代谢组学分析，结果表明，SVs导致基因功能发生改变，从而使得SVs突变组中的菌与代谢物不相关，而不含SVs突变组中菌与代谢物显著相关。相关性分析表明，11个菌与粪便、血清和尿液中的代谢物显著相关，其中涉及到889个受SV影响的细菌-代谢物关联对（图3b,3c）。SVs与代谢组学的关联分析发现，70个SVs影响了细菌与74个粪便代谢物显著性关联，31个SVs影响了细菌与66个尿液代谢物的关联，2个SVs影响了细菌与 2个血清代谢物显著关联。之前的研究中，inositol已被发现与Anaerostipes hadrus的缺失突变有关，而本文研究中发现Bacteroides uniformis基因组的基因座上插入突变和缺失突变均使得该菌与尿液样本中inositol的关联消失。12个SV-affected基因的存在，使得Fusicatenibacter saccharivorans与粪便样本中Neotrehalose的关联不显著（图3d）；同样，33个SV-affected基因的存在使得Agathobacter rectalis与F1P间的关联不显著（图3e）。功能分析的结果也表明SVs通过影响相关基因的功能对菌和代谢物关联产生影响。为进一步研究SVs突变对表型的影响，选取横截面队列样本中受SVs影响的两个代谢物F1P和neotrehalose与空腹血糖做关联分析，发现F1P和neotrehalose均与空腹血糖显著负相关，且F.saccharivorans与空腹血糖也显著负相关，但在SVs亚组中，关联变得不显著（图3h）；SVs的存在也使得A.rectalis与glucose的关联减弱(图3i)。图3. 肠道微乐鱼电竞中与SVs相关的功能研究结果由于噬菌体侵染细菌基因组和病毒的逃离均会导致SVs的产生，因此用ProphageHunter对所有MAGs进行分析，得到基因组大小在1236bp和91792bp间以长尾噬菌体Siphoviridae和肌尾噬菌体Myoviridae为主的2247个原噬菌体（图4a）。对原噬菌体元件和细菌基因组进行关联分析，得到1,077个原噬菌体-宿主对（图4b）；其中，只有72个在MVP数据库中；而二代测序数据只检测到1815个原噬菌体，其中80.77%在混合组装中检测到；从结果我们可以看出，ONT-二代混合组装数据更有利于原噬菌体的发现。除原噬菌体外，菌群基因中还有用于抵抗病毒重复感染的CRISPR-Cas系统，该系统中loci的spacers包含有特定病毒的特征序列，可能与菌种的插入突变或者缺失突变有关。同样，对所有MAGs的分析发现了150058个CRISPRspacers，平均每个样本中1665±560个spacers，大部分的spacers是新发现的，只有17,600个（11.73%）在CRISPROpenDB数据库汇总，22962（15.30%）在西方人群的肠道菌群中出现；基于二代测序的组装方式，只发现了9542个spacers。由此我们也能看出，新的宏基因组组装方式具有更强的发现基因元件（如CRISPR spacers）的能力。对原噬菌体/CRISPR spacers的β多样性分析发现（Jaccard distance距离），横截面队列中个体的差异性显著大于跟踪队列个体内的差异性。群体水平对原噬菌体和CRISPR spacers的组成分析表明两者间有较强的共变；能揭示原噬菌体和病毒群落组成间相关性的Procrustes分析结果表明，横截面队列中不同个体间原噬菌体和病毒组成显著相关（图4c）；对宏基因组数据中活性病毒序列的分析发现，2247个鉴定出的原噬菌体汇中有47个有潜在活性的，从而表明细菌基因中存在大量无活性的原噬菌体，从而保持SVs的稳定性。图4. 肠道菌群汇中与病毒和CRISPR相关的研究结果本研究建立了基于三代测序和二代测序的混合组装方式，不仅提高了数据质量，也能检测出大量包括插入突变和基因倒位在内的结构变异，也有利于原噬菌体以及CRISPR spacers等基因元件的发现。同时通过横截面队列和纵向跟踪队列数据的分析，发现SVs在不同个体间存在较强的异质性以及个体内的稳定性；通过功能分析和代谢组学分析，发现SVs能影响菌群与代谢物和表型间的关联。文/阿趣代谢组学...
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